復發酵實驗；輕微振蕩初發酵試驗陽性結果的發酵管，用3mm接種環將培養物（2-3環）轉接到EC培養液中，在44.5℃±0.5℃下培養24h±2h（提高培養溫度可造成不利于來自自然環境的大腸菌群的生長）。培養后立即觀察，發酵管產氣則證實為糞大腸菌群陽性。

 

濾膜法：濾膜是一種微孔性濾膜，孔徑0.45μm。將水樣注入已滅菌的放有濾膜的過濾器中，經過抽濾，細菌即被截留在膜上，然后將濾膜貼于M-FC培養基上，在44.5℃±0.5℃下培養24 h±2h。糞大腸菌群菌落在M-FC培養基上呈藍色或藍綠色，其他非糞大腸菌群菌落成灰色、淡黃色或無色。正常情況下，由于溫度和玫瑰酸鹽試劑的選擇性作用，在M-FC培養基上很少見到非糞大腸菌菌落。

 

兩種方法的注意事項：

  1、培養溫度的要求  總大腸菌群中的細菌除生活在腸道中外，在自然環境中的水與土壤中也經常存在，但此等在自然環境中生活的大腸菌群培養的zui合適溫度為25℃左右，如在37℃培養則仍可生長，但如將培養溫度再升高至44．5℃，則不再生長，而直接來自糞便的大腸菌群細菌，習慣于37℃左右生長，如將培養溫度升高至44．5℃仍可繼續生長。因此，可用提高培養溫度的方法將自然環境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區分，兩種方法也都基于此理。將接種好的樣品或裝有濾膜的培養基放入生化培養箱時，箱內溫度一定要達到所要求的溫度（44.5±0.5℃）時，方可放入。如用恒溫水浴箱時，其水面要高于接種物面，放濾膜的培養皿要沉到水浴箱底部。

  2、加氯水樣的處理  經氯處理消毒過的水樣，水中含有一定量的余氯，使大腸菌群處于受損或受抑制狀態，在采集水樣時應提前在采樣瓶中加硫代*，硫代*可以脫氯，使受損的細菌得以復蘇與修復，從而避免出現計數結果偏低甚至假陰性的現象。此外余氯對濾膜法培養的細菌其抑制作用尤為明顯，所以抽濾時應對水樣進行大量無菌水稀釋，以減少余氯的殘留。

  3、樣品的保存  采樣用的容器使用前應蓋好瓶蓋，用牛皮紙將瓶蓋和瓶頸處包裹好，置干燥箱160℃-170℃干熱滅菌2h，或用高壓蒸汽滅菌器121℃滅菌15min。采樣后水樣的正確保存也很重要，如保存不當可使樣品中的大腸菌群細菌死亡或在一定條件下再生長，這些都將影響檢測結果的準確性。檢測室接到水樣后，應立即檢測，如因故不能檢測時，應立即將樣品置于冰箱內（2℃-10℃）并于2小時內檢測。

  4、培養物質的制備與保存

    ⑴.多管發酵法所使用的培養液在分裝于各發酵管中后，應將發酵管盡快放于高壓蒸汽滅菌器中，在115℃滅菌20min（注意：這個溫度也應控制好，既達到滅菌的作用，還要防止培養物質分解流失），然后貯存于冰箱或暗處備用。

    ⑵.濾膜法所采用的M-FC培養基多使用外購的成品，培養基中苯胺藍的純度和質量往往影響菌落的顏色，因此，無菌包裝的成套培養基在使用前，先接種典型糞大腸菌，以觀察對比菌落的顏色，來鑒定其穩定性。

  5、結果統計 

    ⑴.多管發酵法的結果是根據不同接種量的發酵管所出現陽性結果的數目，從MPN表中查得相應的MPN指數，來計算每升水中糞大腸菌群細菌的MPN值。MPN是“Most Probable Number”的縮寫，指zui大可能數，它是根據統計學理論，估計水體中的菌群密度和衛生質量的一種方法，所以準確判斷不同接種量發酵管的陽性數是非常重要的，否則將導致較大偏差。

    ⑵.濾膜法的結果是計數濾膜上呈藍或藍綠色的菌落，來計算出每升水樣中的糞大腸菌群數。所以為便于計數，減少誤差，理想的水樣體積是一片濾膜上生長20-60個糞大腸菌群菌落。文章出自www.chejingtong.com